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生物试验室操作标准 IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】 生物试验室操作标准 生物试验室标准 1. 进入试验室需求在试验室运用挂号簿上挂号，没有经过培训的人员不允许独自进 入细胞间； 2. 进第二间屋子换上门口拖鞋，外套脱下，换上白大褂； 3. 进细胞间，换上拖鞋，并换上相应的白大褂； 4. 放在试验室的任何化学药品需求贴上标签，写明试剂称号、联络方式，不然一概 废物处理； 5. 放入细胞间的物品需用酒精擦洗外包装。放入冰箱的物品外围需用酒精擦洗，然 后注明试剂称号、运用者，远离培育基； 6. 有毒、易挥发试剂在外间通风柜内操作； 7. 双手触摸过任何未灭菌的东西后，都需用酒精消毒后才干触摸灭菌的用具或试 剂； 8. 值勤同学：晚上开紫外灯，早上关掉；废物箱满了倒掉；废液瓶满了，参加次氯 酸钠后倒掉；一切的仪器是否封闭；试剂是否收好；衣服、鞋子是否摆好。 生物试验室间运用要求 试验前的例行查看与消毒办法 1. 减压阀查看：减压阀是连接在 CO2 培育箱与 CO2 气瓶间的减压设备，用于将气瓶 内较高的压力下降至培育箱能够运用的压力。接近气瓶的一级压力表盘指示气瓶 内气体压力，当该压力小于时，标明 CO2 气体缺乏，应及时购买气体。 远离气瓶的二级压力表盘指针应在之间，若超出此规模请依据箭头指示调理 旋钮（留意：a 旋钮感觉越紧，阀门开口越大；b 指针示数会由于培育箱对橡胶管 内气体的连续吸气而跳动，调理旋钮时留意延时要素，并将跳动规模操控到 间）。 2. CO2 培育箱查看：温度显现应在（℃）之间，CO2 浓度在（%）之间，禁止私自改 变设置。底部增湿盘中水量缺乏 1/3，应及时增加无菌去离子水，禁止增加自来 水。 培育箱长时连续电重启后，应仅设置温度为 37℃，CO2 浓度设置为零，待培 养箱温度安稳在 37℃六小时后，再设置 CO2 浓度为 5%。 3. 医用冰箱查看：医用冰箱在安稳状况下冷藏温度应为 4℃，冷冻温度应为-20℃， 若示数改动应及时联络管理员。 4. 例行消毒： a. 在房间无人状况下，每周翻开紫外消毒灯 30 分钟至少 2 次； b. 试验前后，用现已被 70%酒精浸湿 的纸巾擦洗生物安全柜操作台； c. 试验前后，别离翻开生物安全柜内的紫外灭菌灯至少 30 分钟； d. CO2 培育箱底盘去离子水两周 替换一次，每次增加%的新洁尔灭溶液； e. 每四周 清洗一次 CO2 培育箱，将托盘、水盘等拆开，并用 70%酒精对培育箱 内部箱体及零件悉数擦洗一遍； f. 每两周 用次氯酸钠漂白水稀释液清洗试验室地上； g. 平常应随手用酒精擦洗桌面，确保桌面整齐。水浴锅内应及时增加或替换去离 子水，视详细状况而定。 相关厂家联络方式 1. CO2 气瓶：纯度标准三个九，千禧京城，，，气瓶 1000 元左右，有空瓶后能够充 气，约二百元； 2. CO2 修理保养：见培育箱箱体； 3. 移液器与电动移液枪修理：北京龙跃伟逸科贸，，； 4. 生物安全柜修理：青岛海尔特种电器有限公司，； 5. 医用冰箱修理：青岛海尔特种电器有限公司，； 6. 离心机：江苏省金坛市医疗仪器厂，，。 细胞间操作标准 1. 试验操作有必要替换试验区拖鞋，穿戴白大褂，佩带无菌手套，应勤用酒精对前臂 及双手消毒； 2. CO2 培育箱内部环境十分适合微生物繁衍，故一切从外界拿入培育箱内的物品均 需求用 70%酒精提早擦洗消毒，在对培育箱操作之前必须对双手及前臂消毒； 3. 一切即将运用或用过的试剂及容器 必须当即标示运用人的名字首字母、日期、试 剂称号或状况 以防其他试验人员混用或误认为是洁净的无菌容器而形成污染； 4. 一般状况下不允许 拿出生物安全柜内器械，若有必要在安全柜外运用器械，则应在 运用后经 70%酒精细心擦洗消毒后放回安全柜内； 5. 安全柜的无菌气流由上自下吹过，并在操作台外表分红前后两股气流进入循环系 统，故应尽或许避免不洁净的物品（如双手、运用过的耗材等）呈现在无菌物品 上方，操作应尽量在安全柜中心部分进行，特别不能置无菌耗材于前风幕与外界 环境的交界处； 6. 锥形瓶中的生物废液可在参加适量次氯酸钠漂白液消毒后，倒入下水道中，洗净 瓶体后参加厚约 1cm 的次氯酸钠漂白液持续盛装生物废液。运用、污染过的生物 耗材应置于次氯酸钠漂白液消毒后再作为一般废物处理； 7. 运用移液枪及电动移液器时应慢速、当心操作，避免液体触摸枪体，若不慎接 触，应当即用 70%酒精擦洗消毒。关于电动移液器，过度汲取液领会阻塞器械管 口，或许形成仪器失效，若替换枪体内过滤器后仍不能正常运用，需联络厂家维 修； 8. 试验完毕后，整理废液烧杯，并用酒精擦洗安全柜台面，当电动移液器电量缺乏 一半时，应及时充电，避免电池老化，敞开紫外灯至少 30 分钟。必须细心查看使 用过的仪器、器件，确认离心机电源封闭，水浴锅锅盖改好，显微镜已封闭，最 后应整理桌面，坚持试验室整齐洁净，废物桶快满时留意将废物带走并换上新的 废物袋； 9. 酒精喷壶、酒精灯中酒精快用完时，留意及时弥补，特别是酒精灯。 细胞培育 细胞培育留意事项 1. 翻开生物安全柜紫外灯消毒 30 分钟以上，敞开安全柜前玻璃面板，至少运转风机 10 分钟以上，确保气流安稳； 2. 提早将培育液置于 37℃水浴锅加热（留意不要被紫外线照耀以防损坏营养成 分）。若旧培育液耗尽，则应当即在新培育液的容器上标示运用人的名字；加热 时刻不宜过长，到达室温即可； 3. 对双手消毒后翻开培育箱，将培育瓶瓶盖旋紧后取出样品并放入安全柜，符号传 代次数，将加热至室温的培育液取出，并用酒精擦洗消毒（留意不要擦洗有字区 域）后放入安全柜。 培育液成分 1. HL-60 细胞所选用的全培育基成分为 89%RPMI-1640、10% FBS 和 1% 双抗（青 霉素/链霉素）； 2. HeLa 细胞所选用的全培育基成分为 84%DMEM、15% FBS 和 1% 双抗（青霉素/ 链霉素）。 细胞复苏 1. 将细胞从液氮中的冻存盒取出，用镊子夹着冻存管置于 37℃水浴中，不断晃动冻 存管（尽量避免冻存管封口处浸入水中，以防细胞被污染），使其快速彻底融 化，得到细胞悬浮液； 2. 用移液枪将细胞悬浮液吸出放入离心管中，15ml 离心管都行，用 15ml 多加培育 液，可将 DMSO 去除更洁净），参加适量（的培育液并混匀，然后进行离心去除 悬浮液中的 DMSO，设定离心转速 800r/min 左右，离心 4 分钟左右； 3. 弃去离心管中上层含 DMSO 的冻存液，一般参加新培育基 4~5ml（依据培育瓶和 或培育皿的容积确认），混匀，然后移入培育容器中。 留意：假如细胞存活率不高，可测验先参加适量新培育液直接培育，一天后再换新培 养液，依据试验成果来看，刚冻结细胞对离心较灵敏。 细胞传代 悬浮细胞传代 1. 用 5mL 移液枪吸走 4/5 的细胞悬浮液（大约为 4ml）； 2. 换新枪头，参加与吸走悬液相同量的新培育液； 3. 用移液枪混匀，放入培育箱； 留意：假如需求精确传代，则需对细胞悬液进行计数，然后保存所需数目的细胞 进行培育。 贴壁细胞传代 1. 用旧液体悄悄冲刷培育瓶底，然后用移液器枪吸尽旧培育液（弃去）； 2. 参加 2ml 左右 PBS，悄悄摇晃，然后相同用移液枪吸掉 PBS（用 PBS 是为清洗掉 旧培育液中的血清，由于血清可抑制胰酶的活性，后边也是选用含血新鲜培育液 中止胰酶消化的）； 3. 参加约~1ml 胰酶（为惯例 5ml 的培育瓶和 5ml 培育皿的用量，没有明晰约束，只 奥胰酶能潮湿一切细胞即可），室温或放置 4~5 分钟，培育箱中放置 1~2 分钟 （放置于显微镜下调查，细胞变圆时就能够中止消化）； 4. 参加约 1ml~2ml 培育基（含有小牛血清）中止消化； 5. (a) 如中止消化后，大部分细胞还贴壁，则可直接吸走胰酶和培育液的混合物，然 后参加适量新培育液，然后将细胞和培育液混合均匀，取适量到新培育瓶/皿中， 持续培育。 (b) 如中止消化后，大部分细胞已脱落到胰酶和培育液的混合液中，则需进一步将 细胞吹离瓶壁，混合均匀，然后取适量细胞悬到离心管中进行离心 800 ~1000r/min，5~3 分钟，然后离心管中上清液去除，参加新培育液，将细胞吹打重 悬。取适量到新培育瓶/皿中，持续培育； 6. 传代完毕后，对双手、前臂及培育瓶消毒后，将培育瓶置于培育箱内并旋松瓶 盖，确保培育瓶透气。 细胞冻存 1. 重复细胞传代中消化细胞的过程，将细胞经过胰酶消化下来，相同参加适量含 FBS 的培育液中止胰酶消化，然后用移液枪将细胞转移至离心管，设定离心机转 速 1000r/min 左右，离心 3 分钟左右，去除上层培育液，留下底部白色细胞团； 2. 细胞团中参加冻存液（90%彻底培育液+10%DMSO，较灵敏细胞可用 90%FBS +10%DMSO。加 DMSO 是为避免细胞被冰晶刺破，用 FBS 替代彻底培育液是为 削减水分），用移液枪悄悄吹打制成细胞悬液； 3. 分转到冻存管内，的冻存管每个可参加至，将冻存管口封严，贴上标签，注明冻 存时刻、细胞品种及代数； 4. 按下列次序降温，并终究冻存：室温、4℃ 冰箱放置 30min 、 -20℃冰箱放置 2h 、-70℃冰箱过夜（咱们无此温度冰箱，放在液氮外表 8h 至 16h 替代）、投入 液氮。 留意：预备冻存的细胞，最好是对数期成长的细胞，一般取细胞铺满底部 70%左右时 可消化冻存，等细胞铺满底部时，细胞一般不是最佳状况。悬浮细胞可在惯例换 液前几小时操作。 首要设备操作阐明 安全柜运用阐明 1. 向上推进翻开玻璃窗（不要超越面表上符号的刻度）； 2. 大约 2 分钟后风速安稳（操控面板上风速不改动），再进行操作，假如在翻开玻 璃窗之前紫外灯是翻开的，则最好多等几分钟，以使紫外光发生的臭氧被排出； 3. 试验操作完成后，用酒精擦洗台面； 4. 封闭玻璃窗，设定紫外灯敞开时刻。 留意：试验操作过程中，假如袖子或其它物体遮住过滤网，安全柜会正告风速不稳 定，尽量避免呈现这种状况。 进一步详细操作可参阅安全柜阐明书。 培育箱运用阐明 1. 翻开培育箱之前现在手上和门把手处喷上酒精；操作时不要和周围的人攀谈以防 口中细菌进入培育箱； 2. 断电后，待温度上升到 37 度，再设定二氧化碳的浓度为 5%，不然二氧化碳传感 器不精确。 进一步详细操作见培育箱阐明书。 显微镜运用阐明 每次运用的开端和完毕时刻需精确挂号，特别是封闭汞灯的时刻，详细的运用操 作见显微镜运用阐明。 操作过程如下： 一、 明场调查 1．接通电源线，翻开电源开关（“︱”为开，“○”为关），一起按下显微镜前面的 按纽（有灯泡）； 2．用光路挑选杆挑选“调查”光路（有眼睛图形），挑选所需扩大倍数的物镜，并 将挑选环置于相应的方位，运用光调理旋钮和滤光片，调理至恰当亮度； 3．将标本放在载物台上，滚动粗微调调理视界内图象明晰； 4．调理目镜使调查舒适； 5．如需摄影，则翻开电脑，挑选所需软件，将光路杆调至“旁路光口”（有相机图 形），即可拍照并保存； 6．运用完毕后，封闭主开关（至 O），取下电源插头。 二、 DIC 调查 1. 翻开通场电源开关（“︱”为开，“○”为关）； 2. 将样品置于载物台上，用样品夹夹好； 3. 将起偏器、检偏器、DIC 棱镜推入光路，荧光滤块转盘拨到“1”方位，DIC 棱镜 应与相应的物镜倍数相匹配； 4. 先选用低倍物镜（“10×”）； 5. 调理透射光的强度，调理焦距，找到视界； 6. 换到高倍镜头，调查样品，DIC 调查时，光路挑选拉杆拉到中心方位，既可观 察，也可摄影。 三、 荧光调查 1. 如运用荧光，翻开荧光光源，此刻最好封闭明场光源。将荧光光路 shutter 翻开 （“○”为开，“●”为关），需维护样品时封闭 shutter； 2. 挑选所需波段的荧光，并用荧光调理杆调理亮度； 3. 从低倍镜开端调查，调焦，找到预调查视界，顺次换到高倍镜头，调查样品； 4. 不调查时，要及时运用光栅堵截荧光（●－关，○－开），避免样品荧光衰 减，如荧光较暗，将周围光亮度减至最低（关灯，拉上窗布）； 5. 拍照过程同普透明场调查。 四、 软件功用简介 1. 图画叠加、主动守时拍照（ISO=200 时比较明晰）； 2. 比例尺设定（可设定标尺的参数）； 3. 可调理布景光色彩以到达白平衡，然后得到线. 调理曝光时刻可改动得到图画的亮暗程度。 留意事项 1. 光纤不能大视点曲折避免折损； 2. 在运用完毕关机时,将镜体电压调至最低, 即确保光的强度最弱才可封闭电源， 避免从头开机时电压高而烧坏灯炮； 3. 不要频频开关电源;为了延伸汞灯运用寿命,请在翻开电源后 15 分钟之内不要关 电源,第2次从头开机间隔时刻最少 10 分钟;一起主张汞灯每次运用不超越 2 小时； 4. 电脑主机机箱后边插着的相似 U 盘的器件，不要拔掉（那不是 U 盘！）； 5. 关于光源的操控也要留意，滚动光强调理钮时切忌当心，不行过分，以防损 坏； 6. 运用完毕后必定要将物镜置于载物台下方，坚持清洁。这一步能够经过滚动三 孔转换器完成；不要随意离散物镜； 7. 对目镜、物镜、聚光镜等光学部件的外表有尘埃时,应先用吹气球吹,再用棉签 蘸清洁液擦洗,办法是由内向外螺旋型擦洗，清洁液主张运用 70%和 30%无水酒 精混合液；一起留意不要随意擦洗荧光激起块； 8. 将镜头转到低倍镜，取出样品，若运用过油镜用洁净的擦镜纸擦洗镜头； 9. 载玻片不同厚度时，需求滚动物镜上的校对环才干得到最明晰图画。 灭菌锅运用阐明 1. 翻开电源按钮（前面板右上方）； 2. 一手按住顶盖靠身体处（有手型标志），然后另一手将前面板左上方的开关拨到 右上方，此刻顶盖翻开； 3. 查看灭菌锅水位是否处于底部中心大孔和周围 8 个小孔之间。假如低于大孔，则 需求加水，可将灭菌锅自带冷凝壶中的水倒入（注：冷凝壶中的水位要坚持在 LOW 与 HIGH 之间），也可参加纯净水和去离子水，不要用自来水，避免发生水 垢；假如处于大孔和小孔之间，则可将需灭菌器件用纱布包好放入到金属框中 （必定要放入金属框中），置于灭菌锅中灭菌。对瓶装水灭菌时，留意将瓶盖拧 松，让水蒸气排放晓畅，避免爆破； 4. 盖好顶盖，翻开顶盖左下方操控面板的操控程序开关，灭菌时参数为：灭菌温度 120 度，灭菌时刻 20 到 40 分钟，灭菌完毕后保温温度为 60 度（保温温度没有明 确要求）。灭菌半途，可按操控面板的 stop 键强制中止，强制中止后翻开盖子 前，请留意显现器中显现灭菌锅中的温度和压强，以防烫坏； 5. 灭菌完毕及时取出被灭菌器件，然后放入枯燥箱中，封闭电源按钮（灭菌锅进一 步操作阐明，去查阅产家阐明书）。 枯燥箱运用阐明 1. 翻开左旁边面左下角的电源按钮； 2. 按箱体前侧左下方操控面板的 Call 按钮，然后上下键设定参数（首要设定枯燥温 度 80，枯燥时刻已设定 48 小时后主动封闭，有些不需求枯燥 48 小时，如急用的 话，枯燥后直接取出就行。参数一般按默许即可）； 3. 按 Start 按钮，开端升温枯燥。 电子天平运用阐明 开机后留意预热 20 分钟，不然或许称量成果不精确。